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抗原多肽

admin 2020年01月15日 08:47 views 0

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抗原多肽本申请是2001年6月20日提交的题为“抗原多肽”的中国专利申请01811545.4的分案申请。技术领域本发明涉及一种鉴定由病原微生物所表达的抗原多肽的方法;包含所述多肽的 疫苗;制备所述多肽的重组方法;和针对所述多肽的治疗用抗体。背景技术微生物引起的大量致死或致弱的疾病,影响着全世界数百万人。控制微生物的 现有方法包括应用抗微生物制剂(抗生素)和消毒剂。它们被证明是有问题的,由于暴 露在这些制剂的环境中所形成的显著的选择性压力导致了耐药性微生物的产生,这些微 生物能够躲避抗微生物制剂的作用。例如,近来已发现微生物对三氯生产生了耐药性, 而在家庭及工业环境中使用的许多消毒剂中都添加有三氯生。一个越来越引起争议的问题是许多重要的病原微生物进化出了对抗生素的耐药 株。例如,但并不限于所举的例子,估计全世界超过5千万人感染了耐药的结核病 (TB)(数字来自世界卫生组织,1998)。过去使用抗生素治疗结核病依赖于单一药物(如 乙硫异烟胺),因此产生了较高频率的耐药性。由于这个原因,现在治疗结核病采用联 合用药。但即使联合用药进行治疗,由至少对一种用于治疗结核病的药物产生耐药性的 菌株所引起的治疗失败的比率仍然接近50%。导致TB的分枝杆菌是一种慢性生长的细 菌,需要花费很长时间消灭它。所以,联合用药若要产生疗效,TB患者必须每天服用组 合药物至少6个月。病人通常必须每天服用两种或更多种药物,并需要相当长的治疗期 限。许多病人仅是断续服药而没有完成彻底根除分枝杆菌感染的全部疗程。再者,TB 与艾滋病感染有密切联系,因而TB的产生是与免疫抑制紧密相关的。抗TB的疫苗已经应用了许多年。作为一种对潜在的可能感染TB的大量人群的 安全和廉价的预防手段,卡介苗(BCG)已在长时间内广泛应用于全世界。BCG是从牛 分枝杆菌获得的减毒活疫苗。但是预防接种对TB感染的效果不大,所以BCG对全面控 制这一疾病的作用是有限的。金黄色葡萄球菌是病原微生物对抗生素产生耐药性的另一个例子。金黄色葡萄 球菌是一种通常寄居在约20-40%普通健康人鼻腔上皮内表面的细菌,也常在人皮肤上发 现,通常不会引起疾病。但在某些场合,特别是当皮肤受损时,这种细菌能引起感染。 在医院里这是一个特殊的问题,因为在那里病人会进行外科手术和/或服用免疫抑制药 物。这些病人由于他们所接受的治疗更易受金黄色葡萄球菌的感染。近年来已产出现了 金黄色葡萄球菌的耐药株。对甲氧苯青霉素的耐药株已很普遍,这些耐药株也对另外几 种抗生素有耐药性。目前对金黄色葡萄球菌还没有有效的预防接种措施。在美国,每年 两百万住院感染中的13%是由金黄色葡萄球菌感染引起的。这表示沈0,000人感染金黄色葡萄球菌,其中60-80,000人死亡。因此,金黄色葡萄球菌是一种重要的人类病原菌,能引起许多威胁生命的疾 病,包括败血症、心内膜炎、关节炎和中毒性休克。其致病力是由其微生物的多样性 及其致病成分的毒力决定的。致病原因是多因素的,任何单一致病成分均不能解释一 个特定的感染,见Projan,S.J.& Novick,R.P.(1997)著《人类疾病中的葡萄球菌》 (Crossley, K.B.& Archer, G丄.,eds.) pp.55-81。在感染初期,及发展阶段,微生物的需要及其环境发生改变,相应地,金黄色 葡萄球菌所产生的致病毒素随之发生改变。在感染开始时,病原体粘附于宿主组织是关 键性的,于是便产生了大量与在细胞表面粘附相关的蛋白质,包括胶原结合蛋白、血纤 蛋白原结合蛋白和纤粘连蛋白结合蛋白。病原体还具有产生能减少吞噬作用或是干扰细 胞被循环抗体识别的因子的能力,从而逃避宿主的防御系统。通常,感染病灶会发展为一个脓肿,其中细菌大量滋生。金黄色葡萄球菌通过 产生一定数量的感受肽能监测其自身的细胞密度。肽的积累以及所伴随的生理变化,引 起细胞的营养不足,从而使细胞所产生的致病毒素从粘附素转变为引起浸润和组织穿透 的组分。这包括多种溶血素、蛋白酶和其他降解酶等。在任何感染过程中,金黄色葡萄球菌所产生的致病毒素是随环境和生理刺激而 改变的。这些刺激取决于体内局部的环境并随着感染的进程而改变。由于对体内的情况 所知甚少,并且某些毒素组分似乎仅能在体内的环境下产生,所以一些可能成为疫苗的 组分不能为早期的技术所发现。近代药物历史中最重要的发展之一是疫苗的发展,其对各种病原微生物的感染 提供了预防性保护。许多疫苗是由灭活的或减毒的病原制成的,然后注射给个体。经免 疫的个体通过产生体液(抗体)和细胞(溶细胞的T细胞,CTL’ S)应答而做出反应。 例如,肝炎疫苗的制备是通过加热灭活病毒和用像甲醛这样的交联剂处理。减毒病原的 一个代表例子是由活病原弱化产生的脊髓灰质炎疫苗。但是对特定疾病应用减毒疫苗是存在顾虑的,因为缺乏对于减毒过程的本质和 条件的病理学知识的了解。这个问题对于特定病毒制剂而言尤其突出,这是因为病毒, 特别是逆转录病毒,具有错误倾向的复制周期,导致含有病毒的基因产生能够传代的突 变,其结果是被用做疫苗的抗原决定簇的发生改变。替代使用灭活的或减毒的病原的一 种方法是鉴别出免疫系统对其特别敏感的病原表位。由此,许多由病原微生物在感染过 程中产生的致病毒素,对于开发具有保护个体免于受到特定致病微生物感染作用的疫苗 是特别有用的。发展亚单位疫苗(疫苗其免疫原是由特定的病原微生物表达的一个蛋白质或复 合体的一个片段或亚基)已经成为医学研究的焦点。对鉴别出用于发展亚单位疫苗的候 选分子的需求,显然不仅仅是因为近来抗生素耐药性的出现已经成为用传统化学疗法控 制致病微生物的严重障碍。已经发展了许多方法来确定有可能用作疫苗的抗原多肽。在 此举一个方法以作说明。许多年来已知肿瘤细胞能产生一些肿瘤细胞特异性抗原,其中 一些出现在肿瘤细胞表面。免疫系统识别这些抗原并将其作为外来物,然后产生针对自 身抗原的抗体,这叫自身抗体或自身抗血清。这种技术之一是重组表达克隆抗原的血清学识别,简写成SEREX。典型地说,这一技术包括从肿瘤组织中提取RNA,然后从分离的总RNA中的选 择性富集mRNA。mRNA用病毒逆转录酶反转录为cDNA。这样合成的cDNA再被克隆 进入一个表达载体,并且转化进入一个适当的细菌株。转化的细菌被接种到一个营养适 宜的琼脂平板上,在适宜的生长条件下,亚克隆的cDNA在细菌细胞中由表达载体来表 达。应用基于噬菌体的表达载体可导致细胞自然溶解,例如λ噬菌体或基于噬菌粒的载 体,通过它们的溶解循环引起细胞溶解。释放的多肽被转移至一种合适的膜支持物(如 硝酸纤维素,尼龙),并暴露于从最初自其分离肿瘤组织的病人中获得的自身抗血清。免 疫筛选法可以用于从病人肿瘤组织中鉴定出过量表达或不恰当表达的基因。我们使用这种技术来鉴定感染过程中由病原微生物所表达的抗原多肽。感染中 产生的自身抗血清,被用于筛选一个由基因组DNA产生的表达文库,以鉴定和克隆抗 原。发明内容本发明最广义的方面是涉及在感染中由病原微生物表达的抗原多肽的鉴定。按照本发明的第一方面,提供一种用于鉴定抗原多肽的方法,包括:⑴提供一个编码病原微生物的基因或部分基因序列的核酸文库; (ϋ)转化/转染所述核酸文库至一种宿主细胞;(iii)提供有助于表达所述的转化/转染的基因或部分基因序列的条件;(iv)将所述基因/部分基因序列表达的多肽与从感染或曾经感染过所述致病微生 物的动物获得的自身抗血清相作用;以及(ν)纯化编码与所述自身抗血清相结合的多肽或部分多肽的核酸。在本发明的优选方法中,所述的文库包含一个病原微生物的基因组DNA。理想的所述病原微生物是细菌。更优选地,所述的细菌微生物是从以下选择出来的:金黄色葡萄球菌;表皮葡萄球菌;粪肠球菌;结核分枝杆菌;B族链球菌;肺 炎链球菌;幽门螺杆菌;淋病奈瑟氏球菌;A族链球菌;布氏疏螺旋体;粗球孢菌;荚 膜组织胞浆菌;B型脑膜炎奈瑟氏球菌;弗氏志贺氏菌;大肠杆菌;流感嗜血菌。更优选地,所述病原微生物是葡萄球菌属细菌。理想的病原生物体是金黄色葡 萄球菌或表皮葡萄球菌。在本发明的一个更优选的实施方案中,所述核酸文库是一个λ文库,理想地, 是一个λ表达文库。按照本发明的第二个方面,提供了含有一个DNA序列的核酸分子,所述DNA 序列选自:(i)如 SEQ ID NO : 1-13 中代表的 DNA 序列;(ii)与上述⑴中确定的SEQ ID NO : 1-13所示序列杂交并编码一种致病微生物 所表达的多肽的DNA序列,以及(iii)由⑴和(ii)中所确定的DNA序列的遗传密码所产生的简并DNA序列。在本发明的一个更优选的实施方案中,所述核酸分子是基因组DNA。在本发明的一个优选的实施方案中,提供了一种分离的核酸分子,所述核酸分子在严格杂交条件下与SEQ ID NO : 1-13中所示序列退火。严格的杂交/漂洗条件是本领域的公知常识。例如,核酸杂交体在0.1%xSSC, 0.1% SDS中60°C下漂洗后是稳定的。本领域公知,如果已知核酸的序列,可以计算出最 佳的杂交条件。例如,根据要进行杂交的核酸的GC含量,能将杂交条件确定下来。请 阅Sambrook等(1989)著《分子克隆实验手册》。一个用于计算给定的同源核酸分子间 杂交所需严格条件的普遍公式为:Tm = 81.5°C +16.6Log+0.41-0.63(% 甲酰胺)按照本发明的第三个方面,提供至少一种依照本发明的方法所鉴定的多肽。在本发明的一个优选的实施方案中,根据本发明前面所述的任一方面或实施方 案,所述多肽与一种微生物的感染致病力相关。更优选地,所述多肽至少是SEQ IDNO : 14_19之一或一部分。按照本发明的第四个方面,提供了一种核酸分子,其特征在于所述的核酸分子 是一个载体的一部分,所述载体适于促进由所述核酸分子编码的多肽的重组表达。在本发明的一个优选的实施方案中,所说的载体是一种适应于进行原核基因表 达的表达载体。或者,所述表达载体适应于进行真核基因表达。典型地,所述的适应性包括,例如但不限于,提供介导细胞特异性表达的转录 控制序列(启动子序列)。这些启动子序列可以是细胞特异性的,可诱导的或组成性的。启动子是本领域所知的术语,为了清楚的目的,仅举一个例子,但不限于此 例,以说明其如下的特征。增强子元件是顺式作用的核酸序列,通常位于一个基因的转 录起始位点的5’端(增强子也可出现在基因序列的3’端或者甚至位于内含子序列内 部,因此其不受位置的约束)。增强子的功能是增加与增强子连接的基因的转录频率。 增强子的活性是响应与增强子元件特异性结合的反式作用转录因子(多肽)。转录因子的 结合 / 活性(请看《真核转录因子》,David S Latchman,Academic Press Ltd, San Diego 著)依赖于多种环境因素包括,例如但不限于,中间代谢产物(如葡萄糖,脂质),环境 作用因子(如光,热)。启动子元件还包括TATA框和RNA聚合酶起始选择(RIS)序列,其功能是选择 转录起始位点。这些序列也结合于多肽上,所述多肽,和其他事物一起,促进RNA聚合 酶对转录起始点的选择。适应性也包括提供选择标志和自动复制序列,两者均有助于所述载体在真核细 胞或原核宿主中的维持。自动维持的载体称为附加载体。促进载体编码基因表达的适应性包括提供转录终止/多聚腺苷酸序列。还包括 提供内部核糖体进入位点(IRES),其功能是最大表达排列在二顺反子或多顺反子表达盒 中的载体编码基因。这些适应性在本领域是熟知的。这里有一系列关于表达载体的构建和重组DNA 的通用技术的出版物。请看,Sambrook等(1989)著《分子克隆实验手册》,冷泉港实 验室,冷泉港,NY和其中的参考文献;Marston,F (1987)著《DNA克隆技术》;一本 IRL出版的实用手册,Vol III IRL,英国牛津,《DNA克隆》:F M Ausubel等著,《分 子生物学中的通用方案》,John Wiley & Sons,:tnc.(1994)。按照本发明的另外方面,提供了一种生产前述任一方面或实施方案所述多肽的方法,包括:⑴提供一种用本发明的载体转化/转染的细胞;(ϋ)在利于制备所述多肽的条件下培养所述细胞;以及(iii)从所述细胞或其生长环境中纯化所述多肽。在本发明的优选方法中,所述载体编码并因此为所述重组多肽提供一种促进所 述多肽纯化的分泌信号。按照本发明的第五个方面,本发明提供了一种用载体转化或转染的细胞或细胞 系。在本发明的一个优选的实施方案中,所述细胞是原核细胞。或者,所述细胞是 选自真菌、昆虫、两栖动物、哺乳动物、植物的真核细胞。按照本发明的另一方面,提供了一种疫苗,所述疫苗包含至少一种本发明的多 肽。理想地,所述疫苗还包含载体和/或佐剂。载体和佐剂是以下述方式表述。某些多肽或肽抗原含有B-细胞表位但没有T细 胞表位。通过在多肽/肽中加入T细胞表位,或通过将多肽/肽结合到一种含有多个T 细胞表位的免疫原性载体蛋白上,如血兰蛋白或破伤风毒素,能大大增强免疫应答。结 合物由抗原呈递细胞摄取,加工,并通过人白细胞抗原(HLA’ s)II类分子呈递。这使 得在T细胞的帮助下将针对源自载体表位的T细胞的特异性传递给对原始的抗原多肽/肽 具有特异性的B细胞。这能增加抗体产生、分泌和同型转化。佐剂是能够通过调节免疫细胞活性而增加对抗原的特异性免疫应答的一种物质 或程序。佐剂的例子包括,例如但不限于,共刺激分子的激动抗体、弗氏佐剂、胞壁酰 二肽、脂质体。因此佐剂是一种免疫调节剂。载体是一种免疫原性分子,当与第二个分 子结合后会增强针对后者的免疫应答。本发明另一方面提供了一种方法,所述方法包括通过对一种动物施用至少一种 本发明的多肽或其一部分,或本发明的疫苗,使所述动物产生抵抗一种病原微生物的免 疫力。在本发明的一个优选的方法中,所述动物是人。优选地,疫苗或抗原多肽能通过静脉内注射,肌肉注射,或皮下注射等直接注 射接种。进一步地,疫苗或抗原多肽,或许还可以口服。优选地,疫苗能抵抗金黄色葡萄球菌。疫苗也可能抵抗表皮葡萄球菌。显然,疫苗或抗原多肽对于控制或减轻除了人以外的其它动物的病情也是有效 的,例如,但不限于例子,家庭宠物,家畜,马匹。按照本发明的其它方面,还提供了一种抗体或至少其一个有效结合部分,所述 抗体结合至少一种本发明的多肽。在本发明的一个优选实施方案中,所述抗体是一种多克隆或单克隆抗体,其中 所述抗体对所述多肽具有特异性。或者,所述抗体是一种通过重组方法产生的嵌合抗体,其包含所述抗体的可变 区与人类抗体的不变或恒定区。在本发明的另一个替代实施方案中,所述抗体是通过重组方法产生的人源化抗 体,是所述抗体的互补决定区域与一种人抗体的恒定区(C)和可变(V)区的读框的结合。优选地,所述抗体被给予了一种标志,包括一种传统的标记或标签,例如放射 性和/或荧光和/或表位的标记或标签。优选地,针对所述的多肽的所述人源化的单克隆抗体,是由一种适合于转化或 转染原核细胞或真核细胞的表达载体所产生的融合多肽。抗体,也叫做免疫球蛋白,是一种对外来分子(抗原)具有特异性的蛋白分子。 免疫球蛋白(Ig)是一类结构相关蛋白质,包括两对多肽链,一对是轻(L)(低分子量)链 (κ或λ ),一对是重(H)链(Y,α , μ,δ和ε ),所有四条链通过二硫键结合在一 起。重链和轻链都有结合抗原的区域,并且在Ig分子之间是高度可变的。另外,重链 和轻链包括非可变或恒定区域。轻链包括两个结构域。羧基-末端结构域在一种类型的轻链中是基本相同的, 因此被称为“恒定”(C)区。氨基-末端结构域在轻链和轻链间是变化的并构成抗体的 结合位点。因为它的可变性,它被称为“可变”(V)区。坛分子的重链分几个类型,α,μ , δ , ε,和Y (其中还分几个亚型)。装 配好的Ig分子包括一个或多个由相同的两条重链和轻链组成的单位,并从它拥有的重链 获得它的名称。这样,Ig便分成5个型:IgA,IgM, IgD, IgE和IgG(并因重链的不 同而分成4个亚型,例如,IgGl,IgG2,IgG3和IgG4)。关于抗体结构和它们的不同功 能的更详细的解释,可以参考《抗体的应用:一本实验室手册》,冷泉港实验室出版。嵌合抗体是重组抗体,其中小鼠或大鼠抗体的所有可变区与人抗体的恒定区结 合。人源化的抗体是重组杂交抗体,它融合了来自于啮齿类抗体的可变区的互补决定区 与人抗体可变区的框区。也用了人抗体的恒定区。互补决定区(CDRs)位于抗体的重链 和轻链的N-末端结构域,可变区的主要变化多集中在CDRs。这些区域构成位于抗体分 子表面的环状结构。这些环状结构在抗体和抗原之间提供结合表面。非人类动物的抗体可引起对外来抗体产生免疫应答,并由此被从血液循环中清 除。注射到人机体中的嵌合抗体和人源化抗体具有弱的抗原性,因为在重组杂交抗体中 啮齿类(即异类)抗体的量减少,而人的抗体区域不会引起免疫应答。它使得针对该抗 体的免疫应答减弱,并减少了对抗体的清除。这显然对于应用治疗性抗体治疗人类疾病 来说是很需要的。人源化抗体被设计为具有更少“异类”抗体区域,因此与嵌合抗体相 比,人源化抗体是更弱的免疫原。本发明的另一方面是提供一种载体,所述载体适用于按照本发明表达人源化的 或嵌合体的抗体。本发明进一步提供了一种细胞或细胞系,所述细胞或细胞系用编码本发明的人 源化的或嵌合体的抗体的载体转化或转染。本发明进一步提供了一种制备本发明的人源化或嵌合抗体的方法,其包括:⑴提供用一个载体转化或转染的一种细胞,所述载体包括一种编码本发明的人 源化或嵌合体抗体的核酸分子;(ϋ)在有利于制造所述抗体的条件下使所述细胞增殖;以及(iii)从所述细胞中或它的生长环境中纯化所述抗体。本发明进一步提供了一种杂交瘤细胞系,其可产生如前所描述的单克隆抗体。本发明进一步提供了一种用杂交瘤细胞系生产本发明的单克隆抗体的方法。本发明进一步提供了制备一种能产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的一 种方法,它包括以下步骤:i)用一种免疫原免疫一种具有免疫活性的哺乳动物,所述免疫原包含至少一种 具有如SEQ.ID No 14-19中所示的氨基酸序列的多肽或其片段;ϋ)将接受免疫的免疫活性动物的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞;iii)根据与步骤(i)中的氨基酸序列的结合活性筛选出由步骤(ii)中的杂交瘤细 胞产生的单克隆抗体;iv)培养杂交瘤细胞以使其增殖和/或分泌所述单克隆抗体;以及ν)从培养上清液中回收单克隆抗体。优选地,上述具免疫活性的哺乳动物是小鼠。或者,上述具免疫活性的哺乳动 物是大鼠。使用杂交瘤细胞产生单克隆抗体是本领域所熟知的。用于产生单克隆抗体的方 法是由 Kohler 和 Milstein,(自然 256,495-497(1975)),和由 Donillard和 Hoffman(《免 疫学概要》V.II中的“关于杂交的基本原理”,Schwartz编辑1981,该文献列入相关参 考)公布的。本发明进一步提供了应用抗体制造一种药物,以治疗金黄色葡萄球菌引起的败 血症、食物中毒或皮肤损坏。本发明进一步提供了应用本发明的抗体制造一种药物,以治疗表皮葡萄球菌引 起的败血症、腹膜炎或心内膜炎。显然,按照本发明的方法鉴定的多肽将促进治疗性抗体的生产,所述抗体能够 用于一些由病原体感染引起的疾病,例如,败血症、结核病、细菌相关性食物中毒、血 液感染、腹膜炎、心内膜炎、脓毒症、脑膜炎、肺炎、胃溃疡、淋病、链球菌喉炎、链 球菌相关中毒性休克、坏死性筋膜炎、脓庖病,组织胞浆菌病、莱姆病、胃肠炎、痢 疾、志贺菌病。如前所述,病原微生物引起广泛的不同类型的疾病。例如但不限于下表所列的 一些病原微生物及其引起的疾病。

具体实施方式现仅举例说明本发明的一个实施方案并以下述材料、方法、SEQID NO: 1-19 和表1作为参考。材料和方法应用一种S.aureus 8325/4基因组DNA的λ ZAP表达文库。它包括从经过Sau3A 部分消化的全部基因组DNA得到的2-10¾的片段。它被克隆进载体的BamHl位点。 这个文库包括> 10倍基因组的范围。通过对在一个直径9厘米的Petri碟上的大约20,000 个噬菌斑形成单位的初筛挑选噬菌斑对文库进行探测。铺皿所用的细胞,对细胞的处 理,铺皿过程和缓冲液配制均严格参照制造商Mtratagene)提供的操作手册进行。铺皿细胞,大肠杆菌XLl-Blue MRF’,用噬菌体感染并放进3ml含有IOmM硫酸镁的上层LB 琼脂液中,铺在含IOmM硫酸镁的LB平皿上。然后将平皿在42°C孵育4小时。将一 个直径8.5厘米的纤维素滤膜片(之前浸泡在IOmM的IPTG中并在空气中干燥)放在每 个平皿上,并做出定位标志。然后将平皿进一步在37°C孵育3.5小时。将滤膜移去并用 TBST缓冲液漂洗,然后在含有6% w/v脱脂奶粉和3% ν/ν猪血清Migma)的TBST中 4°C下封闭过夜。血清是用于封闭滤膜上的所有蛋白A的克隆。滤膜然后用含有病人血 清(1/5000稀释)的封闭液在室温下放置处理90分钟。抗血清从处于严重金黄色葡萄球 菌感染的恢复期的病人中获得。滤膜然后在TBST中漂洗3次,每次10分钟。第二抗 体用的是结合碱性磷酸酶的山羊抗人全IgGMigma),1/30,000稀释于封闭液中室温孵育 30分钟。滤膜然后按上述方法漂洗,并用标准比色法程序进一步处理。有交叉反应的噬菌斑被定位在琼脂平皿上,被挑入0.2ml的含有0.02ml三氯甲烷 的噬菌体缓冲液中。确定每个被挑入的噬菌斑的效价,然后每个平皿上大约接种200个 噬菌斑。如上所述进行噬菌斑的挑选和筛选以得到单一的,纯的交叉反应克隆。然后纯的克隆被接种(Ιμΐ)到平皿上,产生一个直径0.5厘米的汇合的噬菌斑。 每块平皿上可接种30个单独的克隆。进行一次噬菌斑挑选,并用一种适当的血清对滤膜 进行探测。这样能够检测克隆与其他病人的血清,未被感染的供体血清和抗蛋白A血清 的交叉反应性。采用制造商的方案Mtratagene)将克隆切下以在XLOLR大肠杆菌中插入 一个噬菌粒。进行一个质粒的小量制备,基因组插入的大小由限制性谱决定。使用针 对载体序列的引物,通过DNA测序对克隆插入进行鉴定,所述引物允许测序通过插入位 点。通过将所获得得序列与公共结构域数据库进行比较,可确定所克隆的基因的性质。杂交溶液/条件典型地,杂交条件是用4-6倍的SSPE (20倍的SSPE含有175.3克NaCl,88.2克 NaH2PO4H2O和7.4克的EDTA,溶解至1升,并且调节pH至7.4) ; 5-10倍的封闭溶液 (50倍的封闭溶液含有5克400型的水溶性聚蔗糖,:Pharmacia),5克聚乙烯吡咯烷酮和5 克牛血清白蛋白;10(^§-1.011^/1111超声处理的鲑鱼/鲱鱼精0·; 0.1-1.0%的十二烷 基硫酸钠;任选地,40-60%去离子甲酰胺。杂交温度依核酸靶序列的GC含量的不同而 变化,但典型地是介于42-65°C之间。表1在人血清中识别金黄色葡萄球菌的克隆

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